■ 產(chǎn)品簡介
本產(chǎn)品利用高效重組酶和同源重組原理，只需DNA插入片段末端與載體末端具有15-20個同源堿基序列，就可以在載體的任意位點(diǎn)完成目的片段與載體的克隆重組。本產(chǎn)品可實(shí)現(xiàn)1-4個片段的高效無縫拼接；采用非連接酶克隆體系，可極大地降低載體的自連，保證產(chǎn)品克隆陽性率在90%以上。
■ 產(chǎn)品特點(diǎn)
1. 靈活的克隆位點(diǎn)：任何載體的任意位置。
2. 快速簡便：30分鐘完成載體構(gòu)建。
3. 精確：不會增加任何額外的程序。
4. 效率高：高達(dá)90%陽性克隆率。
■ 無縫克隆流程圖
■ 常見問答
1、“同源序列”指的是特殊序列嗎？
答：無縫克隆要求的同源序列不是某個特殊序列，簡單講同源序列可以直接理解為“相同序列”，即DNA片段的連接處有15-20個相同的序列。
2、最佳克隆位點(diǎn)選擇？
答：在選擇克隆位點(diǎn)時，應(yīng)避免選擇上下游50bp內(nèi)有重復(fù)序列的區(qū)域。當(dāng)克隆位點(diǎn)上下游25bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)時，重組效率將達(dá)到最大。若高于70%或者低于30%，重組效率會受到較大影響。
3、同源序列的長度與退火溫度計(jì)算？
答：同源序列長度推薦15-20bp。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，低于15bp（如10bp），轉(zhuǎn)化率明顯下降；大于20bp（如30-40bp），轉(zhuǎn)化效率差異不大，考慮成本，不推薦20bp以上。
計(jì)算擴(kuò)增引物退火溫度時，只需計(jì)算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，末端同源序列不應(yīng)參與計(jì)算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。
4、無縫克隆插入片段的最短長度？
答：建議插入片段≥100bp。
5、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物帶A尾（或者其他尾）是否影響無縫克隆？
答：任何PCR酶擴(kuò)增產(chǎn)物都可以用于無縫克隆，無需考慮產(chǎn)物末端有無A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會出現(xiàn))。但為了減少擴(kuò)增突變或者產(chǎn)物要求高保真時，建議使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。
6、 酶切產(chǎn)物做無縫克隆是否要做去磷酸化處理？
答：不需要。
7、PCR產(chǎn)物做無縫克隆是否要切膠純化？
答：PCR產(chǎn)物同時滿足以下條件時，產(chǎn)物純化即可，不必切膠純化：
A、PCR模板不為質(zhì)?；蛘哔|(zhì)?？剐圆煌谀繕?biāo)載體；
B、無明顯雜帶且主帶占95%以上。
8、無縫克隆長斑數(shù)較少？
答：主要可能有以下幾種情況：
1）引物設(shè)計(jì)不合適：推薦【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位點(diǎn)+基因特異性擴(kuò)增引物】，GC含量40% - 60%。
2）感受態(tài)細(xì)胞效率低：使用新鮮制備或妥善凍存的感受態(tài)細(xì)胞，確保其轉(zhuǎn)化效率>107 cfu/μg。每次操作時可設(shè)置一組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對照實(shí)驗(yàn)，以檢測感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。選擇克隆感受態(tài)細(xì)胞(如DH5α)，不能選擇表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞。
3）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量不足/過量，或者比例不佳：盡量按照推薦的量和比例配制重組反應(yīng)體系。
4）線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物不純，抑制反應(yīng)：線性化載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物未純化，直接使用時，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如10μL體系不超過2μL。建議線性化載體、插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收純化，純化產(chǎn)物溶解在ddH2O中。
9、出現(xiàn)較多假陽性？
答：主要有以下幾種可能情況：
1）載體線性化不完全：即使是痕量未完全酶切的載體也會產(chǎn)生很高的轉(zhuǎn)化背景?？赏ㄟ^陰性對照檢測載體是否線性化完全，優(yōu)化酶切體系，提高限制性內(nèi)切酶使用量、延長酶切反應(yīng)時間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等都可以有效減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。
2）插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物混有非特異擴(kuò)增產(chǎn)物。建議：①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；②膠回收PCR產(chǎn)物；③鑒定更多克隆。
3）反應(yīng)體系中混入了相同抗性的質(zhì)粒：PCR擴(kuò)增模板(載體或插入片段)為環(huán)狀質(zhì)粒時，若擴(kuò)增產(chǎn)物直接用于重組反應(yīng)，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板會產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)化背景。建議擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DpnI消化或擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化。
10、菌落PCR無條帶？
答：主要有以下可能情況：
1）引物不正確：推薦使用載體的通用引物或至少使用一條通用引物進(jìn)行菌落PCR檢測。
2）PCR體系或程序不合適：沒有目的條帶也沒有空質(zhì)粒條帶。建議優(yōu)化PCR體系、程序；或者提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗(yàn)證；或者進(jìn)行酶切驗(yàn)證。
3）重組失敗：沒有目的條帶，只有空質(zhì)粒的條帶。說明重組不成功，載體線性化不完全，建議優(yōu)化酶切體系。
