細(xì)胞中的RNA可以分為信使RNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA三大類，不同組織總RNA提取的實(shí)質(zhì)就是將細(xì)胞裂解，釋放出RNA，并通過(guò)不同方式去除蛋白，DNA等雜質(zhì)，最終獲得高純度RNA產(chǎn)物的過(guò)程。

RNA提取流程

1.樣品處理

從各種不同來(lái)源樣品（如細(xì)菌、酵母、血液、動(dòng)物組織、植物組織和培養(yǎng)細(xì)胞）,或同一來(lái)源樣品的不同組織（如植物幼嫩葉片、成熟根、莖等）中提取高質(zhì)量的RNA，因細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，樣品預(yù)處理的方式也各有差異。

樣品的要求

最好使用新鮮的樣品或取樣后立即在低溫（-20℃或-70℃）冷凍保存的樣品，避免反復(fù)凍融，因?yàn)檫@會(huì)導(dǎo)致提取的RNA降解和提取量下降。

樣品預(yù)處理方式

植物材料-液氮研磨

動(dòng)物材料-勻漿、液氮研磨

細(xì)菌-溶菌酶破壁

酵母-液氮研磨、玻璃珠處理、混合酶破壁

2.細(xì)胞裂解

異硫氰酸胍/苯酚法（TRIZOL）

這是一種傳統(tǒng)的RNA提取方法，適用于大部分動(dòng)植物材料，但對(duì)于次生代謝產(chǎn)物較多的植物材料提取RNA效果較差。異硫氰酸胍能使核蛋白復(fù)合體解離，并將RNA釋放到溶液中，采用酸性酚-氯仿混合液抽提，低PH值的酚將使RNA進(jìn)入水相，而蛋白質(zhì)和DNA仍留在有機(jī)相，從而可以完成RNA的提取工作。

該法應(yīng)用非常廣泛，適用于包括動(dòng)物組織、微生物、培養(yǎng)細(xì)胞等在內(nèi)的各類動(dòng)物性材料，同時(shí)還適用于次生代謝物較少的植物性材料，如幼苗、幼葉等。該法主要應(yīng)用在動(dòng)物組織和培養(yǎng)細(xì)胞的RNA提取中。

胍鹽/β-巰基乙醇法

適用于各種不同動(dòng)物材料和次生代謝物少的植物材料。

在這種方法中，胍鹽使細(xì)胞充分裂解，β-巰基乙醇作為蛋白的變性劑在實(shí)驗(yàn)全程中可以抑制RNaseA的活性，保護(hù)RNA不被降解。

我公司的“GREEN”系列總RNA 提取試劑盒是基于這種方法開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品，分別適用于各類不同的材料。此系列產(chǎn)品的具體實(shí)驗(yàn)步驟和適用范圍在實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)中有詳細(xì)介紹，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)自己的需要進(jìn)行選擇。

其它方法

有些植物材料多糖多酚含量較高，如植物果實(shí)，番茄的葉子等，有些植物木質(zhì)化程度較高，如根莖等組織。針對(duì)這類材料本公司推出了一種全新的植物總RNA提取試劑，該試劑特別適合于從富含多糖、多酚、淀粉的材料中提取純度高、完整性好的總RNA，有關(guān)的具體步驟將在分論中詳細(xì)介紹，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)自己的需要進(jìn)行選擇。

3. RNA純化及獲得

純化要求

RNA樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶（如逆轉(zhuǎn)錄酶）有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染。排除DNA分子的污染。

純化方法及沉淀

方法一：有機(jī)溶劑抽提法

氯仿抽提

在使用RNA提取試劑進(jìn)行RNA提取時(shí)，常使用氯仿進(jìn)行抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質(zhì)，并促進(jìn)水相與有機(jī)相的分離，從而達(dá)到純化RNA的方法。在本公司的提取RNA的產(chǎn)品中，與TRIzol同型試劑法及其衍生試劑盒。

沉淀

氯仿抽提RNA后，一般采用了異丙醇或乙醇來(lái)沉淀水相RNA。加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉淀20-30分鐘，高速離心，可獲得RNA沉淀。

洗滌沉淀

加入無(wú)RNase的75%乙醇，將RNA沉淀振蕩懸浮，使RNA沉淀中的鹽離子被充分溶解。然后再離心10-30分鐘。再次沉淀RNA。離心后，小心倒掉上清（注意不要倒出RNA沉淀），隨后快速離心1-2秒，將殘留在管壁上的乙醇手機(jī)到管底后，用小槍頭吸凈，超靜臺(tái)中風(fēng)干1-2分鐘（注意不要晾得太干，否則RNA沉淀不易溶解）。

溶解沉淀

加入適量RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。

方法二：硅基質(zhì)吸附法

隨著實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，現(xiàn)已發(fā)展出一種采用吸附材料純化核酸的方法。目前較常見(jiàn)的有：硅基質(zhì)吸附材料、陰離子交換樹(shù)脂和磁珠等。硅基質(zhì)吸附材料因其具有可特異吸附核酸，使用方便、快捷、不使用有毒溶劑如苯酚、氯仿等優(yōu)點(diǎn)，成為核酸純化的首選。

本公司生產(chǎn)的總RNA提取試劑盒（ZP403-ZP407）和GREENspin系列總RNA提取試劑盒即采用硅基質(zhì)吸附達(dá)到RNA分離純化目的，通過(guò)專一結(jié)合RNA的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)，使樣品在高鹽條件下與硅膠膜特異結(jié)合，而蛋白、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)不能結(jié)合到膜上而被洗脫，鹽類則被含有乙醇的漂洗液洗滌，最后用RNase-free ddH2O將RNA從硅膠膜上洗脫下來(lái)。

一些特殊組織的RNA提取

纖維組織

心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關(guān)鍵在于徹底破碎組織。這些組織細(xì)胞密度低，單位重量的組織中RNA含量較低，建議增加起始量。此外，一定要在液氮中將組織徹底磨碎。

蛋白/脂肪含量較高的組織

腦或植物脂肪含量高，酚/氯仿抽提后，上清含白色絮狀物。必須用氯仿再次對(duì)上清進(jìn)行抽提。

核酸/RNase含量高的組織

脾、胸腺等組織的核酸和RNase含量很高，在液氮中研磨，再快速勻漿，能有效滅活RNase。如加入裂解液后變得粘稠，酚/氯仿抽提不能有效分層，則加入更多裂解液可以解決此問(wèn)題。多次酚/氯仿抽提可以去除更多殘留的DNA。如果加入乙醇后馬上有白色沉淀形成，表明可能有DNA污染，可以在核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提或者用Dnase1消化，去除DNA污染。

植物組織和真菌組織

植物組織和真菌組織比動(dòng)物組織更為復(fù)雜，一般選擇在液氮條件下對(duì)樣品進(jìn)行研磨，以避免內(nèi)源RNase降解RNA。如果RNA降解問(wèn)題不能解決，大多數(shù)情況下是樣品中含有的雜質(zhì)所致。許多植物和真菌中的內(nèi)含雜質(zhì)和多糖、多酚等都會(huì)殘留，因?yàn)檫@些雜質(zhì)分子與RNA有一些相似性，可與RNA同時(shí)沉淀或者吸附，因此在植物和真菌組織的提取中，需要用一些特別的步驟或者特別的試劑來(lái)去除多糖多酚等雜質(zhì)的干擾和污染。

RNA評(píng)價(jià)與鑒定

提取得到RNA溶液后，我們需要對(duì)RNA進(jìn)行相關(guān)的質(zhì)量檢測(cè)，以確定它是否符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。RNA用于不同的后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)其質(zhì)量要求不盡相同。cDNA文庫(kù)構(gòu)建要求RNA完整且無(wú)酶等抑制物殘留；Northern blot實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求較高，對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求較低；RT-PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)RNA完整性要求不太高，但對(duì)酶反應(yīng)抑制物殘留要求嚴(yán)格。因此在進(jìn)行不同的實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇不同的方法純化RNA，以達(dá)到最佳的實(shí)驗(yàn)效果。

RNA得率檢測(cè)—分光光度計(jì)法

RNA得率有很強(qiáng)的組織特異性，不同組織RNA的豐度和RNA提取的易難程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來(lái)說(shuō)，可通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)定RNA溶液在260nm處的吸光值來(lái)計(jì)算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、雜質(zhì)濃度和蛋白等有機(jī)物的吸收值。用標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)得在波長(zhǎng)260nm處，1ug/mlRNA鈉吸光度0.025（光程為1cm），即OD260=1時(shí)，樣品中RNA濃度為40ug/ml。通常分光光度計(jì)OD260的讀數(shù)要介于0.15-1.0之間才是可靠的。因此RNA提取結(jié)束后，要根據(jù)大概產(chǎn)量稀釋到適當(dāng)濃度范圍，再用分光光度計(jì)檢測(cè)。按下面的共識(shí)計(jì)算總RNA濃度：

總RNA濃度（ug/ml）=OD260×稀釋倍數(shù)×40ug/ml

RNA純度檢測(cè)---分光光度計(jì)法

通過(guò)OD260/280來(lái)檢測(cè)RNA純度，OD260/230作為參考值。

OD260/280在1.9-2.1之間，可以認(rèn)為RNA的純度較好；

OD260/280值小于1.8，則表明蛋白雜質(zhì)較多；

OD260/280值大于2.2，則表明RNA已經(jīng)降解；

OD260/230值小于2.0，則表明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙醇法殘留。

注意：如果用TE溶解或洗脫RNA，會(huì)使OD260/280值偏大。